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無血清培養基的發展、優化和應用

更新時間:2022-06-24      點擊次數:2480
      1.無血清培養基發展歷程
  隨著生物醫藥產業和生命科學基礎研究對動物細胞培養規模、效率和安全性能要求的不斷擴大和提高,無血清培養基的研制和開發已經成為細胞工程領域的重要課題。動物細胞培養基的發展已有60多年的歷史,其中經典培養基(ClassicalMedia,CM)主要是指20世紀五六十年代一些公開配方的傳統培養基,如MEM、M199、DMEM、RPMI1640、DMEM/F12等,此類培養基需要配合10%左右的牛血清才能使用。由于牛血清成分復雜、批次間差異較大,培養過程中有外源物污染的風險,因此科學家們一直致力于研究牛血清替代物,研發無血清培養基。
  無血清培養基的發展歷經了無血清來源、無動物源、無蛋白和化學成分限定培養基等4個階段,逐步使得無血清培養基的成分更為明確和簡單,進一步提升了無血清培養基在細胞培養中可避免外源物污染等優勢,使其在生物制品和生命科學領域獲得了廣泛的應用和發展。
  1.1無血清培養基(Serum-FreeMedium,SFM)
  無血清培養基,即不添加動物血清。為滿足細胞的生長,此類培養基會添加替代血清功能的成分,如大量動植物來源的蛋白,這使得添加物質的化學成分不夠明確,會對后續處理造成不利影響。
  1.2無動物源培養基(AnimalComponentFreeMedium,ACFM)
  為滿足細胞生長及增殖的需要,此類培養基采用蛋白水解物、重組蛋白或其他化學物質替代動物源蛋白,以避免動物來源的風險,降低生產成本,但該類培養基的產量較低。
  1.3無蛋白培養基(Protein-FreeMedium,PFM)
  無蛋白培養基是指*不含有血清和動物源的蛋白,但仍包括來源于植物蛋白的水解物,如大豆水解物或含有合成多肽等其他衍生物。該類培養基的蛋白質含量極低,水解物不穩定,雖然化學成分明確,有利于重組蛋白的下游分離和純化,但通用性較差,需要針對目標細胞株進行特異性的優化。
  1.4
  化學成分限定培養基(ChemicallyDefinedMedium,CDM)
  化學成分限定培養基是指*無血清、無動物蛋白,也不含植物水解物,是一類化學成分明確的培養基。這種培養基批次間差異小,提高了生產工藝的重復性,并有效降低了純化成本。因為化學成分明確,有利于進行細胞培養的代謝及調控研究,是工業生產抗體和重組蛋白的主流培養基,也是無血清細胞培養基。
  2.無血清培養基優化
  2.1
  優化策略
  通常,為了更好地優化無血清培養基的組分,研究人員采用培養過程分析法、分子生物技術法和統計學設計法。培養過程分析法是指通過檢測細胞培養過程中所需的營養物質及代謝副產物的濃度變化,研究細胞的代謝活動;分子生物技術法可在分子水平上觀察細胞在培養過程中的變化,有助于準確預測細胞的生長和代謝狀態;統計學方法是運用統計學工具優化培養基,并對結果進行分析,盡可能減少試驗次數分析多種因素。
  2.2
  培養基開發和優化中的實驗設計(DesignofExperiment,DOE)
  實驗設計(DOE)是一種計劃實驗和分析所獲得信息的數理統計方法,它的優勢在于一次評估多個組分及其相互作用,減少不必要的實驗規模和數量,并允許觀察培養基組分之間復雜的相互作用。
  在細胞培養基優化過程中,實驗設計分為3個步驟。
 ?、俸Y選,基于現有商業培養基進行篩選,以確定重要組分的群組以及初步優化,如使用簡單的、以實驗為依據的單次單因子(OneFactorataTimeStrategy,OFAT)方法解決復雜的優化。
 ?、趦灮?,基于DOE對已確定的重要組分進行進一步優化,主要優化基礎培養基、補料培養基、一些添加物等,如使用響應曲面法(ResponseSurfaceMethodology,RSM)找出多變量體系中的*優條件。
 ?、垓炞C,對最終的培養基進行放大驗證,分別用優化好的培養基與現用的或商業無血清的培養基培養細胞,比較各自的生長指標與抗體表達水平。
  培養基開發的基本方法
  篩選階段也可基于Plackett-Burman設計,從大量因素中篩選出若干個的影響因子。優化階段使用響應面分析法,常用方法有(圖1a)CentralComposite和(圖1b)Box-Behnken等來確定重要影響因子。
  3無血清培養基的應用
  大部分生物制藥是利用動物細胞生產的,動物細胞培養技術是生物制藥生產工藝的核心技術,而細胞培養基是細胞培養的基礎,是生物制藥生產的關鍵原材料之一。目前細胞培養基廣泛應用于重組蛋白、單克隆抗體、疫苗和基因治療藥物的表達載體等生物制品的生產。
  3.1在單抗和重組蛋白細胞培養平臺的應用
  目前CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)已經成為需要復雜翻譯后修飾的治療性蛋白及單抗藥物生產的宿主細胞,70%以上的動物細胞表達藥物產品都是以CHO細胞表達的。在單抗藥物中使用的細胞培養基基本上是化學成分限定培養基(ChemicallyDefinedMedium)和補料(Feed)。例如,HyCloneActiPro和補料7a/7b是針對表達重組蛋白和抗體的CHO細胞培養基,它是根據細胞代謝途徑分析方法設計的化學成分限定,不含動物源成分的商業化培養基。使用ActiPro培養基適當搭配CellBoost7a/7b補料培養基可明顯提高產量,ActiPro系列適用于多種CHO細胞系列,如CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S。
  3.2在病毒疫苗細胞培養平臺的應用
  自2020年以來,病毒肺炎在世界范圍內爆發和流行,嚴重威脅了人類的生命健康,而病毒疫苗的研發和使用是應對病毒傳播和流行的重要手段。傳統疫苗領域使用經典培養基添加牛血清生產疫苗,血清成分復雜性和外源污染帶來的潛在風險,而無血清培養基可以解決病毒疫苗中的血清問題。在病毒疫苗規?;囵B中,無血清培養的關鍵是設計符合細胞貼壁特性和高細胞密度的無血清培養基。疫苗生產使用的無血清培養基HyCloneVaccineXpress適用于貼壁細胞依賴性細胞系(Vero細胞)的高密度生長和維持,目前已廣泛應用于生產,如流感(Influenza)、寨卡(Zika)、脊灰(Polio)、登革熱(Dengue)和呼吸道合胞體病毒(RespiratorySyncytialVirus,RSV)等多種病毒類疫苗。
  3.3在細胞/基因治療所用病毒載體的生產平臺的應用
  人胚腎細胞系HEK293廣泛用于治療生物制品的生產,如用于基因治療的病毒載體、溶瘤細胞藥物、病毒樣顆粒疫苗、病毒載體疫苗等,通常采用化學限定的的無血清培養基。
  3.4在細胞療法中的應用
  干細胞(StemCells,SC)是一類具有自我修復能力的多潛能細胞,在一定條件下,它可以分化成多種功能細胞。干細胞治療傾向于采用無血清培養基,也有一些用于研究的干細胞培養采用加血清的α-MEM*培養基。在腫瘤治療方面,基于樹突狀細胞(DendriticCells,DC)的腫瘤疫苗被認為是治療惡性腫瘤的一種有效途徑。使用無血清培養可以*解決DC腫瘤疫苗治療中血清干擾的問題。在免疫細胞治療方面,CAR-T、CAR-NK通常也采用無血清培養基培養。
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